ตั้งอยู่ส่วนกลางของวัดพระศรีรัตนศาสดาราม มีกำแพงแก้วล้อมรอบ มีซุ้มประดิษฐานเสมารวม ๘ ซุ้ม พระบาทสมเด็จพระพุทธยอดฟ้าจุฬาโลกมหาราชโปรดเกล้าฯ ให้สร้างขึ้นใน พ.ศ. ๒๓๒๖ เพื่อประดิษฐานพระพุทธมหามณีรัตนปฏิมากร (แก้วมรกต) ที่พระองค์ทรงอัญเชิญมาจากเวียงจันทน์ ตั้งแต่ พ.ศ. ๒๓๒๒ (พบพระแก้วมรกต ครั้งแรกที่เจดีย์ ณ วัดพระแก้ว อ.เมือง จังหวัดเชียงราย)

ในการสร้างพระอุโบสถหลังนี้ใช้เวลา ๓ ปี สำเร็จเรียบร้อยลงใน พ.ศ. ๒๓๒๘ ต่อมา เมื่อประมาณได้เกิดเพลิงไหม้บุษบกทรงพระแก้วมรกตซึ่งโปรดเกล้าฯ ให้ซ่อมขึ้นใหม่ให้ทันฉลองวัดพระศรีรัตนศาสดารามในปลายรัชกาล

หลักฐานการก่อสร้างและรายละเอียดทางสถาปัตยกรรม ของพระอุโบสถในรัชสมัยนี้ไม่ชัดเจนนัก นอกจากบ่งไว้ว่า ฝาผนังรอบนอกเป็นลายรดน้ำปิดทองรูปกระหนกเครือแย่งทรงข้าวบิณฑ์ดอกในบนพื้นสีชาด ฝาผนังด้านในเหนือประตูด้านสกัดเป็นภาพเรื่องมารวิชัยและเรื่องไตรภูมิ

ส่วนฝาผนังด้านยาวเขียนภาพเทพชุมนุมตามแบบที่สืบเนื่องมาจากสมัยอยุธยา ฝาผนังระหว่างหน้าต่างเขียนภาพเรื่องปฐมสมโพธิ หลังคามุงด้วยกระเบื้องเคลือบซึ่งปรากฏว่ามีการแก้ไขในรัชกาลที่ ๓ และ ๔ ในภายหลังดังที่เห็นได้ในปัจจุบัน

พระทวารกลาง เป็นพระทวารใหญ่สูง ๘ ศอกคืบ กว้าง ๔ ศอกคืบ ตัวบานเป็นบานประดับมุกลายช่องกลม ส่วนพระทวารข้างเป็นทวารรองสูง ๗ ศอก กว้าง ๓ ศอก ๑ คืบ ๑๐ นิ้ว ตัวบานเป็นบานประดับมุกกลายเต็ม ซึ่งบานพระทวารทั้ง ๒ แห่งนี้ สมเด็จ ฯ เจ้าฟ้ากรมพระยานริศรานุวัดติวงศ์ประทานความเห็นว่า “เป็นฝีมือที่น่าชมยิ่ง ตั้งใจทำแข่งกับบานที่ทำครั้งแผ่นดินพระเจ้าบรมโกศ ซึ่งอยู่ที่วิหารยอด”

ภายในพระอุโบสถได้รับการตกแต่งอย่างวิจิตรงดงามตั้งแต่เพดานถึงพื้น กลางห้องประดิษฐานพระแก้วมรกตในบุษบกทองคำพร้อมด้วยพระพุทธรูปสำคัญมากมาย